makalah sponge by rahman maulana fkip kimia 2012

BAB I

PENDAHULUAN

A.      Latar Belakang

Bakteriologi adalah ilmu yang mempelajari tentang perikehidupan bakteri. Bakteri merupakan makhluk hidup mikroskopis bakteri. Bakteri merupakan makhluk hidup mikroskopis bersel tunggal (uniseluler). Bakteriologi merupakan bagian dari mikrobiologi. Mikrobiologi merupakan ilmu yang mempelajari perikehidupan makhluk-makhluk hidup yang berukuran miskroskopis (mikroorganisme). Mikrobiologi mengkaji selain bakteri, juga mengkaji tentang virus, fungi, protozoa, dan alga.

Bakteri merupakan organisme yang memiliki dinding sel. Oleh karena itu, jika dikaji dari struktur selnya (kandungan dinding sel), maka bakteri dikelompokkan ke dalam tumbuhan. Jika dikaji dari kemampuan beberapa sel bakteri yang bergerak pindah tempat, maka bakteri dikelompokkan ke dalam hewan. Namun demikian, dalam klasifikasi makhluk hidup dengan sistem 5 (lima) dunia menurut Whittaker pada tahun 1969, bakteri dikelompokkan ke dalam dunia monera (Pelczar., dkk., 1988).

Spons adalah hewan berpori yang bersifat filter feeder sehingga menjadi habitat bagi mikroorganisme untuk bersarang di dalam tubuhnya. Mikroorganisme mempunyai dua peran yang penting dalam sistem biologi spons, yaitu sebagai sumber makanan dan hidup bersimbiosis baik secara inter maupun intra selular (VACELET & DONADEY 1977; FRIEDERICH et al. 1999). Beberapa senyawa aktif yang diisolasi dalam spons juga ditemukan dalam bakteri yang bersimbiosis dengannya, oleh sebab itu beberapa peneliti berpendapat bahwa bakteri terlibat sebagian maupun keseluruhan dalam biosintesa senyawa aktif tertentu dalam spons (BEWLEY et al. 1996; FLOWERS et al. 1998). Untuk membuktikan hipotesa tersebut, maka beberapa peneliti bahan alam laut melakukan penelitian tentang pencarian substansi bioaktif dari mikroba yang bersimbiosis dengan spons.

B.       Rumusan Masalah

1.    Bagaimana mengisolasi bakteri yang bersimbion pada sponge?

2.    Bagaimana mengidentifikasi bakteri yang bersimbion dengan sponge?

C.      Tujuan Penulisan

1.    Untuk mengetahui cara mengisolasi bakteri yang bersimbion pada sponge.

2.    Untuk mengetahui cara mengidentifikasi bakteri yang bersimbion dengan sponge.

BAB II

ISI

A. Bakteri Yang Bersimbion Pada Sponge

Spons adalah hewan berpori yang bersifat filter feeder sehingga menjadi habitat bagi mikroorganisme untuk bersarang di dalam tubuhnya. Mikroorganisme mempunyai dua peran yang penting dalam sistem biologi spons, yaitu sebagai sumber makanan dan hidup bersimbiosis baik secara inter maupun intra selular (VACELET & DONADEY 1977; FRIEDERICH et al. 1999). Beberapa senyawa aktif yang diisolasi dalam spons juga ditemukan dalam bakteri yang bersimbiosis dengannya, oleh sebab itu beberapa peneliti berpendapat bahwa bakteri terlibat sebagian maupun keseluruhan dalam biosintesa senyawa aktif tertentu dalam spons (BEWLEY et al. 1996; FLOWERS et al. 1998). Untuk membuktikan hipotesa tersebut, maka beberapa peneliti bahan alam laut melakukan penelitian tentang pencarian substansi bioaktif dari mikroba yang bersimbiosis dengan spons.

Komunitas bakteri yang berasosiasi dengan spons sebagian besar adalah proteobacteria, bacteroidetes, firmicutes dan actinomycetes (TAYLOR et al. 2007). Mikroba yang potensial sebagai target penghasil senyawa aktif adalah cyanobacteria, jamur dan actinomycetes. Senyawa aktif yang dihasilkan oleh Actinomycetes micromonospora dari spons adalah senyawa antimalaria manzamine (ANG et al. 2000). Senyawa peptida antibakteri telah diisolasi dari spons Hyatella sp. dan bakteri simbion Vibrio sp. (OCLARIT et al. 1994). Beberapa senyawa antibakteri jenis quinolone juga diisolasi dari bakteri simbion spon Homoplysia sp. yaitu bakteri Pseudomonad (BULTEL et al. 1999). Adanya hubungan antara produksi antibakteri oleh mikroba simbion dengan spons telah diteliti oleh NARSINHA & ANIL 2000, yang melaporkan bahwa senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri simbion spons (ά proteobacterium MBIC 3368, Idiomarina sp dan Pseudomonas sp.) sangat dipengaruhi oleh like-protein rekombinan yang terdapat pada biota inang Suberitas domuncula. Penelitian tersebut memperkuat adanya hubungan kerjasama dalam biosintesa metabolit sekunder antara mikroba simbion dengan spons.

 

           Gambar 1. Rare Maldives Berry Sponge

 

Gambar 2. Honeycomb Sea Sponge

Pada penelitian ini dilakukan isolasi bakteri yang berasosiasi dengan spons. Bakteri yang diisolasi kemudian dimurnikan, setiap koloni murni diberi kode, setelah diperoleh koloni-koloni bakteri murni barulah dilakukan penapisan aktifitas antibakteri terhadap bakteri wakil gram positif dan gram negatif. Bakteri Staphylococcus aureus mewakili gram positif dan Escherichia coli mewakili gram negatif disebut bakteri uji, bakteri yang bersimbiosis dengan spons disebut bakteri yang diuji. Isolat bakteri yang telah teruji mampu menghambat atau membunuh bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli kemudian dikarakterisasi untuk diketahui sifat Biokimianya

B.       Alat dan Bahan

1. Alat

a.       Ose, 5 buah

b.      Inkubator, 1 buah

c.       cawan petri, 5 buah

d.      pipet tetes, 15 buah

e.       labu erlenmeyer, 4 buah

f.       neraca, 1 buah

g.      ice box, 1 buah

h.      kantong plastik

i.        pemanas, 1buah

j.        termometer, 1 buah

k.      gelas objek, 5 buah

l.        kertas saring, 5 lembar

m.    tabung reaksi, 5 buah

n.      mikroskop, 1 buah

2.      Bahan

a.    Sponge

b.    Sampel bakteri isolat A, B, C, D dan E

c.    Air laut steril

d.   SWC (Sea Water Completed)

e.    Media padat Zobell 2216E (1/2 strengh)

f.     Akuades

g.    Lugol

h.    Alkohol 96%

i.      Media uji Na⁺

j.      N,N,N,N-tetrametil-p-fenildiamin (TMPD)

k.    Malachite green

l.      Safranin

m.  Media phenol red broth glucose

n.    Reagen H₂O₂

C.      Metode Penelitian

1. Cara Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel bakteri yang bersimbiosis dengan sponge dilakukan di perairan pada kedalaman sekitar 2-10 m. Spons dimasukan kedalam kantong plastik steril kemudian disimpan di dalam ice box dan dibawa ke laboratorium.

2.    Isolasi Bakteri yang Bersimbion pada Sponge

Isolasi bakteri dilakukan dengan menggunakan metode pour plate. Sebanyak 10 gram sampel dibilas dengan air laut steril kemudian dihaluskan baik sisi ektosom maupun koanosom menggunakan mortar dan alu yang telah disterilkan. Sampel kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi 90 mL air laut steril. Selanjutnya sampel yang telah dihomogenasi diambil sebanyak satu mililiter kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml air laut steril, selanjutnya pengenceran dilakukan hingga 10-7. Secara aseptis diambil 1 ml sampel dari tiap-tiap pengenceran, kemudian masing-masing dimasukkan ke dalam cawan petri steril dan dibuat duplo. Media SWC (Sea Water Completed) agar yang telah dicairkan terlebih dahulu dan suhu media ± 45ºC dituangkan ke setiap cawan petri yang telah berisi sampel kemudian dihomogenkan. Setiap langkah tersebut dilakukan secara aseptis. Inkubasi dilakukan dengan posisi cawan terbalik pada suhu antara 28-30ºC selama 24-48 jam. Setelah itu dilakukan pengamatan koloni bakteri yang terbentuk. Koloni bakteri yang terbentuk dipurifikasi menggunakan metode streak plate.

 

                               Gambar 3. Media SWC (Sea Water Completed)

 

                              

Gambar 4. Media SWC (Sea Water Completed)

3.      Identifikasi Bakteri yang Bersimbion pada Sponge

a.    Pewarnaan Gram Bakteri

Peremajaan isolat dilakukan dengan menggunakan media padat Zobell 2216E (½ strength) yang terdiri dari peptone 2,5 g; yeast 0,5g. Bakteri selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruangan. Identifikasi gram bakteri dilakukan dengan menggunakan metode uji pewarnaan gram (Fardiaz, 1989). Sebanyak 2 oles bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose kemudian diletakkan ke gelas objek steril beberapa menit dan dilakukan fiksasi pada udara terbuka. Zat warna kristal violet diteteskan pada gelas objek dan dibiarkan selama 1 menit kemudian dibilas dengan air akuades. Sisa air yang tertinggal pada gelas objek ditiriskan dan diberikan lugol serta dibiarkan selama 1 menit. Gelas objek dibilas kembali kemudian hilangkan warna yang tersisa dengan menggunakan alkohol 96% yang mengalir dan dibilas dengan akuades. Pewarnaan safranin dilakukan pada gelas dan dibiarkan selama 30 detik. Selanjutnya objek gelas dibilas dengan air dan dikeringkan dengan kertas serap (tissue). Preparat ini diamati di bawah mikroskop dengan menggunakan lensa objektif yang telah diberikan minyak immersi. Bakteri Gram positif akan menampilkan warna ungu, sedangkan bakteri Gram negatif akan ditandai dengan warna merah atau merah muda. Pengamatan makroskopis morfologi koloni pun dilakukan meliputi bentuk, tepian, warna dan elevasi.

b.    Uji Na⁺

Isolat bakteri A diambil 1 ose dan digoreskan ke dalam tabung reaksi yang berisi media uji Na⁺ kemudian diinkubasi 1 hari. Hasil positif ditandai dengan adanya pertumbuhan bakteri pada media Na⁺, sedangkan hasil negatif ditandai dengan tidak adanya pertumbuhan bakteri. Uji diulang untuk isolat bakteri B.

c.    Uji Oksidasi

Reagen oksidasi, yaitu N,N,N,N-tetrametil-p-fenildiamin (TMPD) dituang pada kertas saring. Isolat bakteri A diambil dan digoreskan pada kertas saring tersebut. Pengambilan isolat bakteri tidak boleh menggunakan alat yang berasal dari logam (harus dari kayu atau plastik). Reaksi ditunggu selama 30 detik. Hasil positif ditandai dengan munculnya warna ungu, sedangkan hasil negatif ditandaidengan munculnya warna merah muda. Uji diulang untuk isolat bakteri B.

d.   Uji Pewarnaan Endospora

Pewarnaan spora dilakukan untuk isolat bakteri C, D dan E. Isolat bakteri C diambil sebanyak 1 ose dan digoreskan pada permukaan preparat steril kemudian dilakukan fiksasi. Preparat yang telah diberi bakteri tersebut lalu dibungkus dengan menggunakan kertas saring lalu ditetesi malachite green sebanyak 1 tetes dan didiamkan selama 4 menit. Setelah itu kertas saring dilepaskan dan preparat dibilas dengan air mengalir. Setelah itu preparat dikeringkan di atas api spiritus. Setelah preparat kering, safranin sebanyak 1 tetes ditambahkan ke permukaan preparat. Preparat tersebut kemudian didiamkan selama 5 menit. Preparat kemudian diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 1000x.

e.    Uji Fermentasi Karbohidrat

Isolat bakteri C diambil 1 ose dan dimasukkan ke dalam media Phenol red broth glucose lalu diaduk. Media yang telah berisi isolat, diinkubasi selama 2 hari. Perubahan warna yang terjadi diamati. Warna merah mengindikasikan tidak adanya asam, sedangkan warna kuning mengindikasikan adanya asam. Uji diulang untuk isolat bakteri D dan E

f.       Uji Katalase

Isolat bakteri C diambil sebanyak satu ose (ose bulat). Kemudian ditambahkan 2-3 tetes reagen H₂O₂ pada preparat. Diulang untuk isolat D dan E. Hasil positif apabila terbentuk gelembung gas, dan hasil negatif apabila tidak terbentuk gelembung gas.

3.      Hasil dan Diskusi

a.       Pewarnaan Gram

 

        Gambar 5. Pewarnaan gram positif

            Gambar 6. Pewarnaan gram negatif

Pewarnaan Gram dilakukan untuk mengelompokkan bakteri menjadi 2 yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Pada pewarnaan Gram, hasil yang didapat akan ditentukan dari komposisi dinding sel pada bakteri. Pada pewarnaan Gram ini, reagen yang digunakan ada 4 jenis, yaitu kristal violet, iodin, alkohol dan safranin. Bakteri Gram positif akan mempertahankan warna ungu dari kristal violet sehingga ketika diamati dengan mikroskop akan menunjukkan warna ungu sedangkan bakteri Gram negatif tidak dapat mempertahankan warna ungu dari Kristal violet tetapi zat warna safranin dapat terserap pada dinding sel sehingga pada saat dilihat menggunakan mikroskop akan memperlihatkan warna merah.Hasil pewarnaan Gram dapat digunakan untuk mengetahui bentuk morfologi dari keempat jenis isolat yaitu warna dan bentuk sel bakteri tersebut.

Hasil pewarnaan gram untuk isolat A dan B menunjukkan hasil  berwarna merah. Dari hasil tersebut dapat diketahui  bahwa isolat A dan B merupakan bakteri Gram negatif.

Hasil pewarnaan gram untuk isolat C, D dan E menunjukkan hasil berwarna ungu. Dari hasil tersebut dapat diketahui bahwa isolat C, D dan E merupakan bakteri Gram positif.

b.    Uji Na⁺

Uji Na⁺ dilakukan untuk identifikasi kelompok bakteri Vibrio sp. Vibrio sp. merupakan kelompok bakteri halotoleran yang akan mampu bertahan pada lingkungan yang memiliki kadar mineral yang tinggi. Hasil pada isolat bakteri A menunjukkan bahwa bakteri tersebut positif  terhadap uji Na⁺ dengan adanya pertumbuhan bakteri pada media yang mengandung 6% NaCl. Berdasarkan hasil uji-uji biokimia tersebut, isolat A merupakan bakteri dari genus Vibrio sp.

c.    Uji Oksidasi

Uji oksidasi digunakan ini untuk mengetahui bakteri yang menghasilkan enzim sitokrom oksidase. Pada uji oksidasi ini digunakan reagen berupa N,N,N,N-tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD).

Hasil pada isolat bakteri A dan B menunjukkan hasil positif  untuk uji ini jika timbulnya warna ungu setelah direaksikan dengan reagen TMPD. Hasil pada isolat bakteri B menunjukkan hasil positif untuk uji oksidasi yang ditandai dengan timbulnya warna ungu setelah direaksikan reagen TMPD. Berdasarkan hasil uji tersebut isolat B merupakan bakteri Pseudomonas.

d.      Pewarnaan Endospora

Bakteri C, D dan E merupakan bakteri gram positif. Menurut second edition of Bergeys Manual  untuk mengetahui genus dari bakteri gram positif tersebut harus dilakukan pewarnaan endospora. Pada pewarnaan endospora, reagen yang digunakan adalah malachite green dan safranin untuk pewarnaan spora. Hasil dari pewarnaan endospora pada bakteri C setelah dilihat dengan menggunakan mikroskop menunjukkan warna hijau yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut memiliki endospora.

Hasil dari pewarnaan endospora isolat C menunjukkan bahwa bakteri C menunjukkan hasil positif dengan adanya warna hijau setelah dilakukan pewarnaan endospora. Hal tersebut menunjukkan bahwa kemungkinan bakteri untuk isolat C adalah bakteri  Bacillus.

e.     Fermentasi Karbohidrat

Uji fermentasi karbohidrat digunakan untuk mengetahui apakah isolat bakteri tersebut dapat melakukan fermentasi glukosa. Perubahan warna yang terjadi pada media menunjukkan adanya asam sebagai hasil dari proses fermentasi glukosa. Hasil   pada isolat bakteri C, D dan E menunjukkan bahwa isolat dapat melakukan fermentasi glukosa ditunjukkan dengan adanya perubahan warna pada media dari warna merah menjadi kuning. Kemungkinan genus untuk isolat D berasal dari kelompok bakteri Micrococcus.

f.       Uji Katalase

Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian hidrogen peroksida (H₂O₂) menjadi air dan O₂. Hidrogen peroksida bersifat toksik terhadap sel karena bahan ini menginaktivasikan enzim dalam sel. Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkungan aerob harus menguraikan bahan toksik tersebut. Katalase adalah salah satu enzim yang digunakan mikroorganisme untuk menguraikan hidrogen peroksida, enzim lainnya yang dapat menguraikan hidrogen peroksida adalah peroksidase. Pada penguraian hidrogen peroksida oleh peroksidase tidak dihasilkan oksigen.

Penentuan adanya katalase diuji dengan larutan 3% H₂O₂ pada koloni terpisah. Pada bakteri yang bersifat katalase positif terlihat pembentukan gelembung udara di sekitar koloni.  Reaksi kimiawi yang dikatalisasikan oleh enzim katalase terlihat berikut ini:

H₂O₂     →     H₂O    +     ½ O₂

                                                           katalase             gelembung udara

Hasil dari uji katalase isolat E menunjukkan bahwa bakteri menunjukkan hasil positif dengan adanya gelembung gas di sekitar koloni. Hal tersebut menunjukkan bahwa kemungkinan bakteri untuk isolat E adalah bakteri  Arthrobacter sp.

BAB  III

PENUTUP

A.    Kesimpulan

1.    Isolasi bakteri dilakukan dengan menggunakan metode pour plate.

2.    Identifikasi bakteri yang bersimbion pada sponge diawali dengan uji pewarnaan gram, yang dilanjutkan dengan uji biokimia seperti uji Na⁺, uji oksidasi, pewarnaan endos spora, uji fermentasi karbohidrat, dan uji katalase.

B.     Saran

Setelah mempelajari makalah ini diharapkan , para pembaca dapat mengetahui bagaimana cara mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri yang bersimbion pada sponge dan semoga makalah ini dapat memberikan manfaat kepada kita semua.